ELISA实验看似简单，但实际操作中容易遇到各种问题，导致结果不可靠。了解常见错误并采取相应预防措施，是保证实验成功的关键。小鼠ELISA试剂盒的使用需要特别注意以下几个方面。
样本处理与保存的常见问题
样本处理不当是导致ELISA失败的主要原因之一。小鼠血清或血浆样本采集后未及时分离，会导致溶血或细胞因子降解，影响检测结果。样本反复冻融会破坏蛋白结构，导致检测值偏低。建议样本采集后立即离心分离，分装保存于-80℃，避免反复冻融。样本稀释倍数不当也是常见问题，浓度过高会超出标准曲线范围，浓度过低则检测不到信号。建议先进行预实验确定最佳稀释倍数，确保样本浓度落在标准曲线中段。此外，样本中含有高浓度脂质或血红蛋白时，会产生干扰，需通过高速离心或过滤去除。
试剂准备与加样的注意事项
试剂未充分平衡至室温直接使用，会导致反应不充分，影响检测灵敏度。所有试剂使用前需在室温下平衡30分钟，避免剧烈震荡产生气泡。标准品稀释不准确是另一个常见错误，建议使用移液器准确吸取，逐级稀释，避免跳级稀释。加样时未更换吸头会导致交叉污染，建议每个样本使用新的吸头。加样体积不准确会影响孔间一致性，建议定期校准移液器。加样顺序混乱会导致孵育时间不一致，建议按照标准品、样本、空白孔的顺序依次加样。洗涤不全会导致背景值升高，建议每次洗涤时充分浸泡，拍干时避免交叉污染。
孵育与显色的关键控制点
孵育温度和时间控制不当会严重影响实验结果。孵育温度过高或时间过长会导致非特异性结合增加，背景值升高；温度过低或时间过短则反应不充分，信号值偏低。建议使用恒温培养箱，确保温度稳定。孵育过程中未覆盖封板膜会导致液体蒸发，孔间体积不一致，影响结果准确性。显色时间控制不当是常见错误，显色时间过短信号值偏低，时间过长则背景值升高且可能超出检测范围。建议设置多个时间点观察显色情况，当标准品高浓度孔出现明显颜色且梯度良好时立即终止。显色过程中需避光，避免光敏底物降解。终止后需在15分钟内完成读数，避免颜色衰减。
数据读取与分析的常见陷阱
数据读取时未使用空白孔调零会导致结果偏差，建议每次读数前用空白孔调零。标准曲线拟合方法选择不当会影响计算结果，建议根据标准品浓度梯度选择合适的拟合方法，通常四参数拟合更适用于宽浓度范围。样本浓度超出标准曲线范围时，直接外推计算会导致结果不可靠，建议重新稀释后复测。未设置复孔或复孔间差异过大时，直接取平均值会掩盖实验误差，建议设置至少3个复孔，计算平均值和标准差，变异系数应小于15%。最后，需注意不同批次试剂盒间的差异，建议使用同一批次试剂盒完成同一批实验，避免批间差异影响结果比较。
