抗原，是指能在体内引起免疫反应的物质；某一物质能否成为抗原，首先是由它本身的某些性质决定的。多抗取白免疫动物的抗血清，制备较简单，但抗血清成分复杂，除含针对抗原（多个表位）的抗体外，还含有多种其他抗体，亲和力和特异性相对要低于单抗，人ELISA试剂盒且制备周期长，批间差异较大。主要有3类，即自然抗原、人工合成抗原和基因重组抗原。抗原在ELISA试剂盒中应用的抗原要求有较高的特异性、亲和力和纯度。
在使用双单抗一步法时，应注意抗原过剩时的“钩状效应”。而单抗仅针对抗体的单一表位，亲和力和特异性均较多抗高，且制备技术成熟，产量大，批间差异小，但结合位点的单一也正是其弱点之所在，在双抗体夹心法中，如包被和指示抗体使用同一单抗，则由于结合位点的缺乏，等闲造成假阴性结果。人ELISA试剂盒多为体外的蛋白、病菌等各类物质，椰油机体本身的，如自身免疫缺陷病症会对自身产生免疫。

　　抗原的纯度不高，特异性不强；合成抗原一般为多肽片段，缺乏天然抗原所具有的立体结构表位，亲和力不高，可能导致相应表位的抗体漏检：基因重组抗原具有安全、特异性强、亲和力高、产量大等特点，是一种比较理想的抗原，人ELISA试剂盒但其纯化比较挫折。荧光和化学发光测定的敏感度均高于比色测定，标准曲线的线性范围亦较比色反应宽，测定效果优于常用的比色ELISA试剂盒，抗体在ELISA试剂盒中应用的抗体可分为多克隆抗体（多抗）和单克隆抗体（单抗）。