ELISA试剂盒对试剂预备一般不太注意，一般的做法是，在试验时将试剂从冰箱中拿出来即用，而疏忽了这种做法有也许影响后边温育时刻不行的疑问，其直接的结果是对一些弱阳性标本的检查呈现假阴性。因此在ELISA测定中试剂的预备zui为要害的是，在试验开端前，将试剂盒先从冰箱中拿出来，在室温下放置20分钟以上后，再进行测定，以使试剂盒在运用前与室温平衡。这么做的意图，主要是为了在后边的温育反响步骤中，能使反响微孔内的温度能较快地到达所请求的高度，以满意测定请求。其次，如今的产品ELISA试剂盒中的洗板液均需在试验室运用时对所提供的浓缩液稀释制造，因此稀释时所用的蒸馏水或去离子水应确保质量。此外，当试剂盒以OPD为底物时，则底物溶液应在反响显色前暂时制造。
在如今的ELISA试剂盒产品试剂盒中，血清样本的参加几乎是*的要运用微量加样器参加样本的步骤。运用微量加样器加样有必要注意的要害点是：加样不行太快，要避免加在孔壁上部，不行溅起和发生气泡。加样太快，无法确保微量加样的准确性和均一性。加在孔壁上部的非包被区，易致使非特异吸附。溅起会对附近孔发生污染。呈现气泡则反响液界面有区别。试剂的参加在国产试剂盒中基本上均是从滴瓶中滴加，除了要注意滴加的角度外，滴加的速度也很主要，滴加太快，很简单呈现重复滴加或加在两孔之间的现象，这么就会在孔内的非包被区呈现非特异吸附，然后导致非特异显色。所以，有时候一份标本用一样的试剂盒这次测定为阳性，下次测定为阴性，通常即是上述加样及试剂的过错所造成的。
温育是ELISA试剂盒测定中影响测定胜败zui为要害的一个要素。ELISA作为一种固相免疫测定，抗原抗体的反响在固相上进行，要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原*，有必要在必定的温度条件下反响必定的时刻。温育所需时刻与温度成反比，即温度越高，则所需时刻相对较短。zui为常用的温育温度有37℃和室温，其次是43℃和2～8℃。
