目前IHC方法可用许多的方法进行检测，如ABC法、S-P法、CSA法、EnVision法等。可用于标记的酶有HRP、AKP和葡萄糖氧化酶等。zui后可通过酶促反应使其在抗原抗体结合部位转化为一定颜色的可见沉积物，对抗原进行定位、定量分析。这些转化物可根据底物不同，产生不同的颜色，如NBT／BCIP为紫蓝色，AEC／H202为红色，DAB／H202为棕褐色等。而另一种酶促反应可产生一种能在一定波长光照射下生成各种明亮荧光，使IHC敏感性大大提高。Larison等（1995）较早报道了荧光发生素—磷酸酶底物（fluorogenic Phosphate sesubstrate）方法，用于IHC的信号检测放大。该方法将标记在抗体上的碱磷酸催化酶底物，转化成能产生荧光的基团分子。Larison所用磷酸酶底物为2—（5，—氯—2，—羟苯基）—6—氯—4（3H）—喹吡啉，也称ELF-97磷酸盐底物，并检测冰冻切片——石斑鱼视黄醛组织内的多种抗原成分。其操作流程如下。

（1）常规石斑鱼视黄醛组织冰冻切片16t~m厚，经固定，PBS洗。

（2）浸入阻断液内洗30min（阻断液：30mmol／L Tris盐、150mmol／L NaCl、1%BSA、0．5％TritonX-IOO，pH7．5）。

（3）滴加适当稀释特异性一抗，37~C，1h，PBS洗3X3min。

（4）生物素化二抗，37~C，30min，PBS洗3X3min。

（5）链霉亲和素—AKP，37~C，30min，PBS洗3X3min。

（6）荧光信号转化：将切片浸入ELF磷酸盐底物液[ELF磷酸盐底物液：将3t~mol／L2—（5，—氯—2，—羟苯基）—6—氯—4（3玎）—喹吡啉加入至底物缓冲液（底物缓冲液：10mmol／LTris、200mmol／LNaCl、lmmol／lMgCl、0．1mmol／lZnCl2和0．1％二甲亚砜）内]，反应8～12s，快速除去反应底物，用阻断缓冲液（阻断缓冲液：150mmol／LTris、lOOmmol／LED—TA、lmmol／L左旋咪唑、0．05％TritonX—100，pH8．0）洗20min，中止反应。

（7）用0．125~mol／LHoechst33342衬染3min，PBS洗，无水甘油封片。荧光显微镜下观察（激发波长为360nm；发射波长为540nm）。

在荧光显微镜下可见ELF底物产生明亮的黄绿色荧光，沉积在抗原抗体结合部位。Larison等的结果表明，ELF技术在IHC中的应具有以下特点。

（1）克服组织标本的自发荧光。ELF—97乙醇沉积物具有180nm以上的Stokes移位，对于组织细胞内的自发荧光位移小的特点，可以有效克服这种缺点。另外，ELF沉积物的荧光信号强度和持续发光时间要较其他标记二抗的荧光发光高500倍，也可以有效地避开自发荧光的影响。

（2）具有较好的稳定性。ELF-97磷酸盐染色的固定标本可保存数月或数年，很少出现荧光信号的损失。

（3）可用于免疫荧光组织化学的多重标记。ELF产生的亮绿色荧光可与红色荧光（如Texared、罗丹明、藻红蛋白）或蓝色荧光（例如Hoechst、AMCA和Cascade blue）结合进行多重标记。

（4）另外，目前分子探针公司已开发了多种ELF免疫组织化学染色试剂盒和细胞学标记试剂盒。商品化试剂盒提供了一种快速、敏感的检测组织细胞内蛋白质和mRNA的方法。