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Elisa试剂盒的温育是如何进行的
发布时间:2021-11-11   点击次数:155次

Elisa试剂盒的操作因固相载体的形成不同而有所差异,良好的仪器和正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件。国内医学检验一般均用板式点。

Elisa试剂盒的操作步骤:

 方法一:用于检测未知抗原的双抗体夹心法:

 1. 包被:用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1~10μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml,4℃过夜。次日,弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗3次,每次3分钟。(简称洗涤,下同)。

 2. 加样:加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔,阴性对照孔及阳性对照孔)。

 3. 加酶标抗体:于各反应孔中,加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5~1小时,洗涤。

 4. 加底物液显色:于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml,37℃10~30分钟。

 5. 终止反应:于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

 6. 结果判定:可于白色背景上,直接用肉眼观察结果:小鼠ELISA试剂盒反应孔内颜色越深,阳性程度越强,阴性反应为无色或较浅,依据所呈颜色的深浅,以“+"、“-"号表示。也可测O·D值:在ELISA检测仪上,于450nm(若以ABTS显色,则410nm)处,以空白对照孔调零后测各孔O·D值,若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍,即为阳性。

ELISA试剂盒

方法二:用于检测未知抗体的间接法:

用包被缓冲液将已知抗原稀释至1~10μg/ml,每孔加0.1ml,4℃过夜。次日洗涤3次。加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应孔中,加入新鲜稀释的酶标二抗体(抗抗体)0.1ml,37℃孵育30-60分钟,洗涤,zui后一遍用DDW洗涤。其余步骤同“双抗体夹心法"的4、5、6。

其中还有一个步骤特别需要注意那就是洗涤:

洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤,但却也决定着实验的成败。ELSIA就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质,以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的,而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在ELISA操作中,洗涤是非常主要的关键技术,应引起操作者的高度重视,操作者应严格按要求洗涤,不得马虎。

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