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蛋白试剂盒的优点及使用方法
发布时间:2021-12-21   点击次数:113次
   BCA蛋白试剂盒是进行蛋白质浓度测定的最常见的方法之一。BCA蛋白定量的主要原理是:蛋白质在碱性条件下,可以将二价Cu2+离子还原成一价Cu+离子。产生的一价Cu+离子可以与BCA(Bicinchoninicacid)试剂结合,最终生成紫色的复合物。该复合物在562nm处有很强的吸收峰。复合物的多少与蛋白质的浓度呈接近的线性关系。
  
  ​一、BCA蛋白试剂盒有许多优点:
  1、检测的灵敏度高,检测的蛋白质浓度下限可达20μg/mL。
  2、线性范围广,在20-2000μg/mL的范围内,呈接近的线性关系。
  3、兼容性良好,产品可以兼容的化学物质非常广泛。
  
  二、使用方法:
  1、BCA工作液的配制
  (1)BCA工作液总体积的计算:
  BCA工作液总体积=(标准品数量+待测样品数量+1)×重复数×200μL。
  举例:如果标准品数量为8,待测样品数量1,重复数为3,则BCA工作液总体积=(8+1+1)×3×200μL=6000μL
  (2)BCA工作液的配制:按50体积的BCA试剂A中加入1体积的BCA试剂B(A:B=50:1),充分混匀。
  举例:将5000μL的BCA试剂A与100μL的BCA试剂B混合,得到5100μL的BCA工作液。
  
  2、BSA标准品的配制
  将BSA标准品做系列稀释,分别得到如下9个不同浓度的标准品:2000μg/mL,1500μg/mL,1000μg/mL,500μg/mL,250μg/mL,125μg/mL,62.5μg/mL,31.25μg/mL,0μg/mL。
  注:严格的蛋白定量,BSA标准品的稀释溶液应该与待测蛋白样品的溶液相同。但是一般情况下,BSA标准品可以直接用0.9%的NaCl、PBS或者去离子水进行稀释。
  
  3、取BSA标准品和待测样品各25μL到96孔板孔内,
  注:正常情况下,样品与BCA工作液的体积之比应为1:8。如果样品体积有限,也可使用10μLBSA标准品和待测样品进行检测(即样品与BCA工作液的体积之比为1:20),这时BCA定量试剂盒的检测范围较小为125-2000μg/mL。
  
  4、往每孔中加入200μL的BCA工作液,盖上96孔板盖子。
  
  5、将96孔板放37℃,30分钟。
  
  6、用酶标仪测562nm处的光吸收值。
  注:562nm为最强的光吸收波长。如果无法检测562nm处的光吸收值,也可以在540~595nm波长范围内检测光吸收值。
  
  7、根据BSA标准品的光吸收值(扣除空白孔的光吸收值即为最终的读数),绘制标准曲线。依据标准曲线计算待测样品的蛋白浓度。
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