一、原理

酶联免疫吸附试验ELLSA试剂盒是一种固相酶免疫测定的方法，目前广泛应用于各种抗原和抗体的检测。其基本原理是将抗原或抗体固定在固相载体表面，并保持其免疫活性，再与酶标记抗体或抗原联结，并保留酶的活性，然后加入酶反应的底物，后者被酶催化变为有色产物，反应颜色的深浅可与相应抗原或抗体的量相关。在本实验中，（1）用已知抗体包被固相载体；（2）加入受检的标本（含待测抗原），使抗原与固相上的抗体结合；（3）加入以辣根过氧化物酶标记的已知抗体，使之与抗原结合。标记的酶可催化底物（四甲基联苯胺）起显色反应，从而指示特异性抗原抗体反应的存在。

二、器材与试剂

器材：

（1）50~250μl可调微量移液器与移液头（2）37℃培养箱、搪瓷盒（3）酶标架（4）洗瓶（含洗涤液）、吸水毛巾（5）酶标检测仪

试剂：

（1）已包被抗体的酶标条（2）400μg/L抗原溶液（3）抗原稀释液（4）待测标本1、2（5）酶标抗体（6）洗涤液（pH7.2 PBS-Tween 20）（7）底物A、B溶液（8）终止液

三、操作步骤

ELLSA试剂盒取已包被抗体的酶标板，分别在第1~6孔各加入抗原稀释液100 ul，第6、7孔各加入400μg/L抗原溶液100 ul，从第6~2孔进行对倍稀释（zui后在第2孔吸出的100 ul弃去）；在第8、9孔各加入100 ul待测标本1；在第10、11孔各加入100 ul待测标本2。置酶标板于37℃，保温30分钟。

弃去孔内液体，以洗涤液注满孔内，置3分钟后甩干孔内液体，重复3遍。上述孔内再加入酶标抗体100ul。置37℃，保温30分钟。

弃去孔内液体，以洗涤液注满孔内，置3分钟后甩干孔内液体，重复4遍。

各孔均加底物A和底物B溶液各100ul，混匀。置37℃，10分钟左右加入终止液50ul 中止反应。

将酶标板置酶标仪上比色，以第1孔调零，在450nm波长处读取光密度值（O.D值）。

结果判断：以O.D值为纵坐标，抗原标准浓度（0;12.5;25;50;100;200;400μg/L）为横坐标在半对数坐标纸上画出标准曲线，再根据样品的平均O.D值在标准曲线上查出各自的含量。

四、ELLSA试剂盒操作注意事项

正确掌握微量移液器的使用方法：吸液时将按钮按至*止点，排液时则应尽力按足按钮（至第二止点）。

酶标板的正确洗涤：加洗涤液时应小心，勿使洗涤液溢出，流入周围孔中，造成交叉污染。洗涤后应尽量甩干孔内残液。洗涤液加入孔后，须保持三分钟再弃去。

注意加样顺序，加样品时应注意从zui高稀释度逐一加至zui低稀释度。