以抗体包被的夹心法为例，加入板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有zui贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。ELISA试剂盒37℃是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度．
在建立ELISA方法作反应动力学研究时，实验表明，两次抗原抗体反应一般在37℃经1～2小时，产物的天生可达。ELISA试剂盒湿盒应先放在保温箱中预温至划定的温度，特别是在气温较低的时候更应如斯。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育，有人称之为孵育，在ELISA试剂盒中似不恰当。这就是为什么ELISA反应老是需要一定时间的温育。为加速反应，可进步反应的温度，有些试验在43℃进行，但不宜采用更高的温度。ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。
温育常采用的温度有43℃、37℃、室温顺4℃等。室温温育时要平置于操纵台上即可。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后。不管是水浴仍是湿盒温育，反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。
保温的方式除有的ELISA仪器附有特制的电热块外，一般均采用水浴，可将ELISA试剂盒板置于水浴箱中，ELISA板底应贴着水面，使温度迅速平衡。为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜笼盖板孔，此时可让反应板漂浮在水面上。ELISA试剂盒若用保温箱，应放在湿盒内，湿盒要选用传热性良好的材料如金属等，在盒底垫湿的纱布，zui后将ELISA板放在湿纱布上。应留意温育的温度和时间应按划定力求正确。抗原抗体反应4℃更为*，在放射免疫测定中多使反应在冰箱中过夜，以形成zui多的沉淀。室温温育的反应，操纵时的室温应严格限制在划定的范围内，尺度室温温度是指20～25℃，但详细操纵时可根据仿单的要求控制温育。在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如斯。为保证这一点，一个人操纵时，一次不宜多于两块板同时测定.。但因所需时间太长，一般不予采用。
