在临床实验室，对试剂准备一般不太注意，通常的做法是，在实验时将试剂从冰箱中拿出来即用，而忽略了这种做法有可能影响后面温育时间不够的问题，ELISA试剂盒其直接的后果是对一些弱阳性标本的检测出现假阴性。因此在的是在实验开始前，将试剂盒先从冰箱中拿出来，在室温下放置20分钟以上后，再进行测定，以使试剂盒在使用前与室温平衡。这样做的目的，主要是为了在后面的温育反应步骤中，能使反应微孔内的温度能较快地达到所要求的高度，以满足测定要求。其次，

①磷酸钠盐缓冲液(0.1mol/LpH6.0)：称Na2HPO4·12H2O2.2g，NaH2PO4·2H2O 6.84g，用蒸馏水溶解，定容至500mL。

② TMB 贮液：称60mgTMB 溶于10mL 二甲基亚砜中，4℃避光保存。

③底物应用液：现用现配，磷酸钠缓冲液10mL，TNB 贮液10μL。30%H2O2 15μL，混匀。

7. 终止液：2mol/LH2SO4

四、操作步骤

①抗原包被：兔抗人IgG 作为抗原，用包被液l：8000稀释，100μL/孔加入聚苯乙烯96孔反应板

中。4℃放置过夜。

②洗涤：次日倾去凹孔内的液体，洗涤液洗3次。

③封闭：加l00μL/孔封闭液，室温放置0.5h。

④洗涤：用洗涤液洗3次。

⑤加待测样品(一抗)：将含单克降抗体的细胞培养上清在另—块板上用PBS 连续稀释(按照1：2或1：10)，100μL /孔加到已包被的板上，每个样品平行做两份，PBS 或空白培养基作为阴性对照，已知样品作为阳性对照。加盖37℃恒温箱温育1~2h。

⑥洗涤：用洗涤液洗3次。

⑦加酶标抗抗体：兔抗鼠IgG-HRP，用封闭液l ：8000稀释，100μL/孔，加盖37℃恒温箱温育1h。

⑧洗涤：用洗涤液洗5次，蒸馏水洗2次。

⑨显色：加新鲜配制的底物溶液100μL/孔，室温暗处放置5～30min，显示蓝色。

⑩终止反应、比色：加50μL/孔终止液.颜色变黄;用酶标仪测定450nm 处各孔的吸光值，阳性反应的zui大稀释度为待测样品的效价。

       目前的商品ELISA试剂盒中的洗板液均需在实验室使用时对所提供的浓缩液稀释配制，因此稀释时所用的蒸馏水或去离子水应保证质量。此外，当试剂盒以OPD为底物时，则底物溶液应在反应显色前临时配制。