在ELISA试剂盒中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在ELISA试剂盒板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。加标本一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。每次加标本应更换吸嘴，以发生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加样。

    有此测定(如间接法ELISA)需用稀的血清，可在试管中按规定的稀释度稀释后再加样。也可在板孔中加入稀释液，再在其加入血清标本，然后在微型震荡器上震荡1分钟以保证混和。加酶结合物应用液和底物用液时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，ELISA试剂盒则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA试剂盒提高到新水平。