ELISA试剂盒属固相免疫测定，抗原、抗体的只在固相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例，参加板孔中的标本，其间的抗原并不是都有平等的和固相抗的机会，只需zui贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐，因此需经分散才干到达反响的结尾。在这以后参加的酶符号抗体与固相抗原的也相同如此。这就是为何ELISA试剂盒反响老是需求必定时刻的温育。
有此测定（如间接法ELISA）需用稀释的血清，可在试管中按规则的稀释度稀释后再加样。也可在板孔中参加稀释液，再在其间参加血清标本，然后在微型震动器上震动1分钟以确保混和。加酶物使用液和底物使用液时可用定量多道加液器，使加液进程敏捷完结。在ELISA检查试剂盒中通常有两次抗原抗体反响，即加标本和加酶物后。抗原抗体反响的完结需求有必定的温度和时刻，这一保温进程称为温育（incubation），有人称之为孵育，在ELISA检查试剂盒中似不恰当。
ELISA试剂盒温育常选用的温度有43℃、37℃、室温文4℃（冰箱温度）等。37℃是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体的合适温度。在树立ELISA方法作反响动力学研讨时，实验标明，两次抗原抗体反响通常在37℃经1-2小时，产品的生成可达高峰。为加快
反响，可进步反响的温度，有些实验在43℃进行，但不宜选用更高的温度。抗原抗体反响4℃更为*，在放射免疫测定中多使反响在冰箱中，以形成zui多的沉积。但因所需时刻太长，在Elisa试剂盒中通常不予选用。
保温的方式除有的ELISA试剂盒仪器附有特制的电热块外，通常均选用水浴，可将ELISA试剂盒板置于水浴箱中，ELISA试剂盒板底应贴着水面，使温度敏捷平衡。为避免蒸腾，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，此时可让反响板漂浮在水面上。
若用保温箱，ELISA试剂盒板应放在湿盒内，湿盒要选用传热性杰出的材料如金属等，在盒底垫湿的纱布，zui终将ELISA试剂盒板放在湿纱布上。湿盒应先放在保温箱中预温至规则的温度，特别是在气温较低的时候更应如此。无论是水浴仍是湿盒温育，反响板均不宜叠放，以确保各板的温度都能敏捷平衡。室温温育的反响，操作时的室温应严厉约束在规则的范围内，规范室温温度是指20-25℃，但具体操作时可根据说明书的请求操控温育。室温温育时，ELISA试剂盒板只需平置于操作台上即可。应留意温育的温度和时刻应按规则力求准确。为确保这一点，一个人操作时，一次不宜多于两块板一起测定。
