ELISA实验是生物医学研究中检测蛋白表达水平的重要技术手段，其操作流程的规范性和准确性直接影响实验结果的可靠性。大鼠ELISA试剂盒的操作需要严格遵循标准流程，从样本准备到数据读取的每个环节都至关重要。
样本准备阶段
实验开始前，需要根据检测目标选择合适的样本类型。对于大鼠样本，通常包括血清、血浆、组织匀浆或细胞培养上清液。血清样本采集后需在室温下静置30分钟，待血液凝固后，以3000rpm离心10分钟，取上清液分装保存。血浆样本需使用抗凝剂处理，离心后取上清液。组织样本需在预冷的PBS中匀浆，离心后取上清液。所有样本应避免反复冻融，建议分装后保存于-80℃冰箱。实验前需将样本恢复至室温，并根据预实验结果进行适当稀释，确保样本浓度落在标准曲线范围内。
试剂准备与包被
取出试剂盒后，所有试剂需在室温下平衡30分钟。按照说明书要求配制洗涤液，通常为10×浓缩液稀释至1×工作液。标准品需用标准品稀释液进行系列稀释，建议设置8个浓度梯度，包括空白孔。包被抗体需用包被缓冲液稀释至工作浓度，加入酶标板孔中，每孔100μL，4℃过夜包被或37℃孵育2小时。包被完成后，弃去液体，用洗涤液洗涤3次，每次浸泡1-2分钟，拍干。加入封闭液，每孔200μL，37℃孵育1-2小时，封闭非特异性结合位点。
加样与孵育
封闭完成后，弃去封闭液，拍干。设置空白孔、标准品孔和样本孔。标准品孔加入不同浓度的标准品100μL，样本孔加入稀释后的样本100μL，空白孔加入样本稀释液100μL。37℃孵育1-2小时，使抗原与包被抗体充分结合。孵育完成后，弃去液体，用洗涤液洗涤3-5次，每次浸泡1-2分钟，拍干。加入标记的检测抗体工作液，每孔100μL，37℃孵育1小时。弃去液体，洗涤3-5次，拍干。加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素工作液，每孔100μL，37℃孵育30分钟。弃去液体，洗涤5次，每次浸泡1-2分钟，拍干。
显色与终止
加入底物溶液TMB，每孔90μL，37℃避光孵育15-30分钟。显色过程中需密切观察颜色变化，当标准品高浓度孔出现明显蓝色且梯度良好时，加入终止液，每孔50μL，轻轻震荡混匀，此时颜色由蓝色变为黄色。终止反应后，需在15分钟内完成读数，避免颜色衰减影响结果准确性。
数据读取与分析
使用酶标仪在450nm波长下测定各孔的吸光度值，以空白孔调零。绘制标准曲线，以标准品浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，采用四参数拟合或线性回归方法拟合标准曲线。根据标准曲线方程计算样本浓度，注意样本稀释倍数。对于超出标准曲线范围的样本，需重新稀释后复测。实验需设置复孔，计算平均值和标准差，确保结果的重复性和可靠性。最后，根据实验目的进行统计学分析，得出科学结论。
